武汉大学张先正团队 ACS Nano: 酶驱动嵌合肽靶向细胞膜用于增强肿瘤的光动力免疫治疗

【背景介绍】

最近几十年里，通过光敏剂（PSs）、光和氧气产生高细胞毒性的活性氧（ROS）杀死肿瘤细胞的光动力疗法（PDT）已成为一种新兴的抗肿瘤策略。ROS会不可逆地氧化并破坏邻近的生物分子，从而破坏细胞的正常代谢和生理活性。但是ROS的寿命短且活性半径非常有限，因此在ROS失去活性前将其输送到所需区域非常重要。目前已报道的细胞核、线粒体、细胞膜（PM）等亚细胞靶向策略能显著增强PDT的抗肿瘤效果。此外，也有研究报道PDT能通过诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）来引发抗肿瘤免疫应答。众所周知，肿瘤细胞的ICD过程会伴随着损伤相关分子模式（DAMPs）的表达和释放，DAMPs主要包括钙网蛋白（CRT）、ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）。DAMPs可作为免疫原性信号来激活抗肿瘤免疫响应。然而，DAMPs在细胞凋亡过程中释放缓慢，传统的细胞质PDT（CP-PDT）通过细胞凋亡方式诱导的免疫原性也远远低于细胞坏死诱导的免疫原性。因此，通过靶向并破坏细胞膜来诱导细胞坏死的方式能有效促进DAMPs的快速释放并提高死亡细胞的免疫原性。此外，PDT的抗肿瘤效率也会影响肿瘤相关抗原的呈递和抗肿瘤免疫反应的激活。这种高效的细胞膜靶向PDT策略通过诱导DAMPs的快速释放能激活强大的抗肿瘤免疫响应，在免疫治疗领域具有重要的意义。

【成果简介】

近日，武汉大学张先正教授（通讯作者）团队报道了一种蛋白法尼基转移酶（PFTase）驱动的细胞膜靶向嵌合肽PpIX-C₆-PEG₈-KKKKKKSKTKC-OMe（PCPK），用于PM靶向光动力治疗（PM-PDT）以及通过诱导肿瘤细胞PM损伤和损伤相关分子模式的快速释放（DAMPs）来增强免疫治疗。PCPK靶向PM的能力来源于细胞内K-Ras信号转导，该信号通路能通过PFTase将相应的蛋白靶向驱动到PM上。结合光敏剂原卟啉IX（PpIX），PCPK可以产生ROS使细胞膜表面相关蛋白失活，从而引发脂质过氧化，并在光照射下以极低浓度（1 μm）破坏PM。特定的PM损伤进一步诱导了细胞内DAMPs的快速释放，导致抗肿瘤免疫反应的强度比常规的CP-PDT更强。这种免疫激活的PM-PDT策略在联合程序性细胞死亡的PD-1阻断治疗时展现了较强的转移瘤抑制作用。研究成果以题为“Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy”发表在国际著名期刊ACS Nano上。

【图文解读】

图一、靶向细胞膜（PM）的PDT（PM-PDT）结合PD-1检查点阻断疗法根除原发肿瘤并抑制远端肿瘤的示意图

图二、PCPK和PCPK-SR纳米颗粒的表征
（A-B）PCPK和PCPK-SR的分子结构及其嵌合肽纳米粒子的自组装过程；

（C-D）PCPK和PCPK-SR纳米粒子的TEM图像；

（E-F）PCPK和PCPK-SR纳米颗粒在水溶液中的粒径分布；

（G）在DMF溶液中PpIX和在PBS中PCPK-SR和PCPK的UV-vis吸收光谱；

（H）通过检测530 nm处DCF的荧光强度来测定660 nm光照射下PBS、PCPK-SR、PCPK和PCPK与维生素C的ROS生成效率，；

（I）有无660 nm光照射下，利用ROS敏感的荧光探针DCFH检测PCPK和PCPK-SR的4T1细胞中细胞内ROS产生量。

图三、研究PCPK和PCPK-SR的细胞PM靶向和滞留
（A）PCPK在细胞内的法尼基化过程和PM靶向作用的示意图；

（B）PCPK-SR无法进行细胞内法尼基化过程和PM靶向作用的示意图；

（C-D）PCPK和PCPK-SR与4T1细胞共培养后的荧光图像和相应的荧光强度分布图；

（E-F）4T1细胞与PCPK和PCPK-SR共培养8 h并替换为新鲜培养基后，在不同时间点通过共聚焦显微镜观测细胞内荧光的示意图；

（G-H）在不同时间点替换新鲜培养基后，用PCPK和PCPK-SR处理的4T1细胞的荧光图像和相应的荧光强度分布图。

图四、体外细胞毒性和PM损伤评估
（A）用MMT法测定PCPK和PCPK-SR有无光照下的细胞毒性；

（B）通过MDA法测定对4T1细胞进行多种处理后的脂质过氧化程度；

（C-D）细胞的活/死染色和台盼蓝染色；

（E-F）凋亡坏死染色。

图五、4T1细胞免疫激活研究
（A-B）通过ELISA和ATP试剂盒检测细胞上清液中的HMGB-1和ATP的含量；

（C-D）小鼠血清中的IL-6和TNF-α检测；

（E）体内DC成熟检测；

（F）体内成熟DC的定量分析；

（G）肿瘤阻止HMGB1免疫荧光染色。

图六、4T1荷瘤小鼠的体内抗肿瘤研究
（A）PCPK介导的PM-PDT联合抗PD-1免疫疗法抑制原位瘤和远端瘤的示意图；

（B-C）在2周评估期内采用不同治疗方法后，原位瘤和远端瘤的相对肿瘤体积；

（D）在2周评估期内4T1荷瘤小鼠的体重；

（E）治疗后第14天的原位瘤和远端瘤的肿瘤图像；

（F-G）原位瘤和远端瘤的H＆E和TUNEL染色图像。

图七、体内免疫激活研究
（A）4T1荷瘤小鼠远端瘤的肿瘤浸润性T淋巴细胞的检测；

（B）4T1荷瘤小鼠远端瘤的肿瘤浸润性T淋巴细胞的定量分析；

（C）4T1荷瘤小鼠远端瘤组织颗粒酶B免疫荧光染色；

（D）红色荧光颗粒酶B的MFI值。

【小结】

综上所述，作者报道了PFTase驱动的肿瘤细胞PM靶向的嵌合肽PCPK用于PM-PDT和免疫激活。通过体外和体内实验证明，对比PCPK-SR介导的CP-PDT，PCPK介导的PM-PDT的抗肿瘤效果有着显著的提高。此外，通过免疫分析进一步证实了PCPK介导的PM-PDT将引起DAMPs的快速释放，从而诱导比CP-PDT更强的系统性免疫反应。结合免疫阻断剂PD-1，可以检测到较强的抗肿瘤免疫反应，并有效抑制转移性肿瘤。总之，该工作报道的高效细胞PM损伤和快速DAMPs释放的PM-PDT策略可以显著提高PDT效率并引发抗肿瘤免疫反应，在抗肿瘤的免疫治疗方面具有巨大的应用潜力。

文献链接：Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy. (ACS Nano, 2019, DOI: 10.1021/acsnano.9b04315)

本文由CQR编译。

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