流式细胞仪的原理、应用及最新进展

前言

流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，已经成为近代科学研究中的热门专题，研究它的论文数量也在逐年上升。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以流式细胞术为核心技术，集光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术于一体的先进科学技术设备。它被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域，是现代科学研究中的先进仪器之一，被誉为实验室的"CT"。

1 流式细胞仪的工作原理和技术指标

1.1 流式细胞仪工作原理

图1为流式细胞仪基本结构。它主要有四部分组成：流动室和液流系统；光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。将待测细胞荧光染色后制成单细胞悬液，在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。以激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的细胞在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。前向小角度的光散射信号（forward scatter,FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter，SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况。激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。这些光信号转化成电信号，被传送到计算机，经A/D转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。细胞的分选是将待测液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下偏转，落入不同的收集容器中，从而实现细胞的分离。

图 1 流式细胞仪结构示意图

1.2 流式细胞仪性能的技术指标

流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、分析参数多少及分析、分选速度及纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号的荧光分辨率小于2.0%，有的甚至在1%之内。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力，一般用荧光微球上可测出的荧光（FITC）的最小分子数来表示。目前仪器可以达到100以内。一般分析速度为500-10000个细胞/s，分选速度控制在1000个细胞/s以下，分选纯度>98%,有的仪器（如 MoFLo High-Performance Cell Sorter）分析速度可达100000个细胞/s，分选速度可达70000个细胞/s，分选纯度>98%。应用方向不同，分析参数的多少差异较大，少的（如Guava PCA-96）可以分析3个荧光参数和1个散射信号，多的（如CyFlow SL）可以分析13个荧光参数和3个散射信号。

2 流式细胞仪的应用

2.1 在临床上的应用

细胞癌变过程中伴随细胞DNA含量的改变，DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志。流式细胞仪的FSC能够给出这些信息，在肿瘤的早期诊断和鉴别诊断中有着很重要的作用；早在80年代人们发现特定T细胞亚群可以反映AIDS患者的临床状态，而流式细胞仪可以对这些T细胞亚群进行检测，为AIDS的诊断、治疗提供有用信息；流式细胞仪借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数完成白血病及淋巴瘤的诊断，准确率达90%左右，较传统形态学检查准确性提高10%-20%；流式细胞仪对淋巴细胞及其亚群数量的检测，可以探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案。

2.2 在生物学及微生物学上的应用

从早期到现在，在细胞及细胞器方面很多已被人们所接受的科技，都经流式细胞仪研究过。在细胞功能的早期研究中，研究者仅能通过观测微生物的吞噬来研究噬中性粒子,而流式细胞仪可以通过它们的大小、形状、抗体及吞噬过程中微生物种类、数量的变化更深入的辨别、研究这些噬中性粒子；氧自由基的实时、单细胞繁殖评价，DNA倍体分析，细胞循环中细胞增殖和凋亡分析等都会用到流式细胞仪；流式细胞仪对细胞周期可以轻松分析，促进了以此为基础的植物学的发展，辅以成像仪器，流式细胞仪可以对微生物的成长、繁殖进行3-D研究。

2.3 在生殖学及制药学上的应用

利用对精子DNA进行无害标定的DNA染料(如Hoechst 33342)或H-Y抗体都可以对精子进行检测和分类，完成生殖学上的要求；FCM检测肿瘤细胞的耐药相关蛋白的表达水平，对检测临床肿瘤化疗效果及药物的选择有一定的意义。此外，流式细胞仪在细胞毒，可溶性蛋白质分子，钙离子浓度检测等都有很广泛的用途。此外，流式细胞仪在细胞毒，可溶性蛋白质分子，钙离子浓度检测等都有很广泛的用途。

3 流式细胞仪的最新发展

3.1 仪器功能专业化

Partec CyFlow、BD FACSCount可以实现CD4,CD8,CD3绝对计数，用于HIV检测的经济普及型流式细胞仪。

3.2 仪器全面自动化

免疫标本制备仪、组织样本制备仪和样品前处理仪在实验中得到广泛应用。不同规格的多孔板或多试管自动进样器加速了自动化进程。Epics XL、FACSCalibur 等主流厂家仪器都实现了自动化。

3.3 多色多参数分析迅速发展，分析、分类速度加快

新兴荧光探针的不断开发和仪器软、硬件的逐步更新，流式细胞仪的多色荧光分析得到了迅速发展，对细胞亚群的识别更准确、更精细。

3.4 仪器小型化

适应实际需要的小型化、便携式流式细胞仪也是一个发展的趋势。最近几年，微流体流式细胞仪成为研究的热门方向，在这方面的研究也越来越多，取得了一定的科研成果。

3.5 仪器功能增强化

鉴于拉曼光谱易于识别的特点，Dakota A. Watson 等对能够探测拉曼光谱的流式细胞仪进行了研究，这将使细胞的多参数测量提升一个档次。

3.6 理论的新发展

An-Shik Yang等采用SIMPLEC迭代算法对流式细胞仪液体流动的理论模拟结果与文献公布的实验数据吻合很好，为微流体流式细胞仪的流体室设计提供了理论参考。

另外，试剂盒荧光试剂、液相芯片技术、定量流式细胞分析、仪器模块化等也是流式细胞仪的发展趋势。

4 未来展望

本文对流式细胞仪的原理、应用、发展现状和趋势作了简明扼要的论述，使科研者和使用者有一个更深刻的了解和认识。随着科学技术的进步，流式细胞仪专业化区分更加明显，科研型大型仪器和普及性应用仪器成为两个主流；随着光电技术的发展，相信流式细胞仪能够在测量多色荧光参数的时候，给出多参数分析结果，同时完成分类，实现实时同步分析的功能，这对临床医疗快速诊断意义重大。

本文转载自作者赵书涛等人，材料牛石小梅编辑整理。