中国药科大学孙敏捷组Adv. Funct. Mater: ATP超敏型蛋白团簇用于肿瘤深层渗透及放大MRI引导的光热治疗

研究背景：

近年来，蛋白或基于蛋白的诊疗试剂（PBTA）受到越来越多科研工作者的关注。这其中，包括治疗蛋白如细胞因子、单抗、生物酶等，可以作为生物大分子药物，在抗肿瘤治疗中表现出优良的活性。另外一些则是生物相容性蛋白，如白蛋白、血红蛋白、转铁蛋白等，可以作为治疗性小分子药物、染料或诊断剂的载体。然而，目前已报道的蛋白诊疗剂由于其在肿瘤中蓄积、渗透或选择性差等种种问题，很大程度上限制了其体内应用以及临床转化。我们知道，纳米粒子的粒径在肿瘤滞留、渗透中扮演着至关重要的角色。通常来讲，粒径较小的纳米粒子具有较强的渗透能力，却同时伴随着较差的肿瘤滞留；而粒径较大的粒子恰恰相反，表现出较强滞留及较差渗透。目前已开发的大部分蛋白诊疗试剂粒径均分布在2-20 nm，该小粒子很容易通过肾清除排出体内，其体内生物半衰期不到1小时，使得疗效大打折扣。

成果简介：

近期，中国药科大学药学院孙敏捷教授团队基于“沙拉（SALAD，Small-Assembling-LArge-Disassembled）”式递药原理，开发出一种细胞外微环境ATP超敏蛋白团簇（DEP/GdCuB）成功攻克这一瓶颈。研究人员首先合成了包载了Gd³⁺和CuS的诊疗一体化白蛋白纳米小粒子（GdCuB, 9 nm），并与ATP敏感材料糊精-乙二胺-苯硼酸（DEP）组装形成蛋白团簇（DEP/GdCuB, 120 nm）。较大的蛋白团簇不仅能够延长小粒子的循环半衰期，还能够使得小粒子在血液中的T₁加权成像效果减弱，降低背景信号。而当团簇蓄积到肿瘤部位，胞外的ATP分子能够快速反转DEP的电荷，从而触发GdCuB的释放，促进深层渗透以及T₁加权MRI的激活。这一策略同时实现了蛋白粒子在肿瘤部位有效蓄积及深层渗透，并用于放大T₁加权磁共振成像（MRI）引导的光热治疗。该成果近日以“Size Switchable Nanoclusters Fueled by Extracellular ATP for Promoting the Deep Penetration and MRI Guided Tumor Photothermal Therapy”为题发表在知名期刊Advanced Functional Materials杂志上。

图文导读：

图一、ATP超敏性蛋白团簇（DEP/GdCuB）的制备及其体内作用原理示意图

（A）在血液循环中，将蛋白小粒子制备成较大的团簇能够延长其循环半衰期，从而增强肿瘤蓄积，同时在血液循环中T₁加权成像处于OFF状态；

（B）当蛋白团簇递送至肿瘤部位时，细胞外的ATP能够快速触发团簇解组装以及蛋白小粒子的释放，实现深层渗透及T₁加权成像的激活。在1064 nm激光照射下，增强的肿瘤蓄积及渗透显著的增强了蛋白诊疗小粒子的光热治疗效果。 

图二、纳米团簇的理化性质表征及ATP超敏感性能表征

（A）在 GdCuB-FITC中加入不同量的DEP后荧光发射光谱变化；（B）制备团簇前后粒径变化；（C）制备团簇前后Zeta电位变化；（D）ATP触发DEP电荷反转示意图；（E）加入不同量的ATP后，不同苯硼酸接枝率材料的zeta电位变化(DEP0接枝率最低，DEP2接枝率最高)；（F）加入不同量的ATP后，不同接枝率团簇的蛋白小粒子释放；（G）荧光共振能量转移（FRET）证明其ATP敏感解体行为；（H）透射电镜TEM观察GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP形貌。

 图三、GdCuB的光热效应以及ATP激活的荧光成像和T₁加权MRI成像

 （A）GdCuB和DEP/GdCuB的UV-Vis扫谱图；（B）1064 nm激光照射后，去离子水、GdCuB以及DEP/GdCuB的红外热成像图；（C）GdCuB以及DEP/GdCuB在激光和非激光处理下对细胞的杀伤作用；（D）ATP触发DEP/GdCuB-FITC的荧光恢复谱图；（E）ATP激活DEP/GdCuB-Cy7的近红外荧光信号放大成像；（F）GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP的T₁加权MRI成像图；（G）GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP的T₁加权MRI成像弛豫系数测定。

图四、ATP激活的肿瘤深层渗透研究

（A）4T₁细胞3D肿瘤细胞球验证DEP/GdCuB-FITC加ATP前后渗透深度；（B） 细胞球60μm深度的2.5D图像分析；（C）流式细胞仪测定加入ATP前后FITC阳性细胞数；（D）流式细胞仪测定加入ATP前后不用时间的细胞平均荧光强度；（E）注射GdCuB-FITC或DEP/GdCuB-FITC 24小时后肿瘤切片。

图五、体内组织分布、药动、MRI成像以及红外热成像

（A）小动物荧光成像系统观察GdCuB-Cy7及DEP/GdCuB-Cy7的活体分布；（B）24 h后离体脏器及肿瘤的荧光信号定量分析；（C）药动学研究；（D）GdCuB及DEP/GdCuB的T₁、T₂加权磁共振成像；（E）激光照射不同时间后，注射了Saline、GdCuB及DEP/GdCuB的小鼠红外热成像图。

图六、体内抗肿瘤药效评价

（A）注射不同制剂后4T₁荷瘤鼠的肿瘤生长曲线；（B）给药16天后，代表性离体肿瘤照片；（C）给药16天后，小鼠各组瘤重统计分析；（D）给药期间小鼠体重监测；（E）16天处理后，肿瘤组织的H&E及TUNEL切片染色。

总结与展望：

在这项工作中，基于“沙拉（SALAD，Small-Assembling-LArge-Disassembled）”式递药原理，我们报道了一种优化蛋白诊疗试剂体内应用的新策略。成功的打破蓄积和渗透的平衡，实现了蛋白诊疗试剂在肿瘤部位的强蓄积以及深层渗透。同时，利用肿瘤微环境细胞外的ATP作为蛋白团簇的触发器，通过苯硼酸和ATP的化学反应驱动阳离子材料电荷反转及蛋白小粒子释放。此外，电荷反转原理表明，该策略同样具有很高的潜力推广应用于表面负电性功能化的纳米小粒子，如Fe₃O₄，Au，量子点等，实现诸如此类纳米小粒子的增效减毒目标。总的来说，该策略为推进蛋白诊疗试剂的临床转化打下了坚实的基础。

文献链接：

Size Switchable Nanoclusters Fueled by Extracellular ATP for Promoting Deep Penetration and MRI‐Guided Tumor Photothermal Therapy. Advanced Functional Materials, 2019: 1904144.DOI: 10.1002/adfm.201904144.

本文由中国药科大学孙敏捷课题组供稿。

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