Adv. Mater.: 双锁纳米粒子扰乱PD-1/PD-L1通路用于有效肿瘤免疫疗法

金也 4年前 (2019-12-03) 5224浏览

【研究背景与研究进展】

CRISPR/CRISPR相关酶(Cas13a)可以在靶向识别后可通过“附带效应”对肿瘤细胞进行选择性杀伤，这使得其在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。然而，这种“附带效应”并不特别针对肿瘤细胞，当在全身给药时可能会引起安全问题。近日，南开大学刘阳教授，史林启教授和天津医科大学康春生教授（共同通讯作者）在国际著名期刊Adv. Mater.上发表相关研究文章，题目为“Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy”。

该研究描述了一种可限制CRISPR/Cas13a对肿瘤组织特异性激活的双锁纳米颗粒（DLNP）。DLNP具有核-壳结构，其中CRISPR/Cas13a系统（质粒DNA，pDNA）被具有双响应聚合物壳层包裹在核内。该聚合物层赋予DLNP在血液循环或正常组织中增强的稳定性，并促进CRISPR/Cas13a系统的细胞内化和进入肿瘤组织时基因编辑的激活。在仔细筛选和优化以程序性死亡配体1(PD-L1)为靶点的CRISPR RNA(crRNA)序列后，DLNP显示了对B16F10荷瘤小鼠T细胞介导的抗肿瘤免疫的有效激活和免疫抑制肿瘤微环境（TME）的重塑，从而显著抑制了肿瘤的生长，提高了荷瘤小鼠的生存率。

【图文简介】

图1 DLNP在有效肿瘤免疫治疗中的示意图

类似于仅在两个锁都解锁时才能打开的双锁保险箱，DLNP只能在低pHe和高H2O2浓度同时存在的微环境中释放CRISPR / Cas13a系统。用这种基于CRISPR/Cas13a的PD-1/PD-L1通路靶向剂，DLNP有效地指导了T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，并对免疫抑制的TME进行了重塑，使抗肿瘤效果和生存率显著提高，且对小鼠的副作用极小。

图2 DLNP、H2O2-NP和pH-NP的结构表征

a）双锁定纳米颗粒（DLNP）的合成示意图；

b）DLNP的尺寸分布和TEM图像。标尺为200纳米；

c）不同条件下DLNP、H2O2-NP和pH-NP的Zeta电位；

d）在37°C的FBS溶液中培养30分钟后，DLNP、H2O2-NP和pH-NP的非特异性蛋白质吸附量；

e）不同条件下培养后DLNP的荧光光谱。PEI-PBA和PEI-HPBA用Cy5预标记；mPEG-b-PLys-SGD/CA和mPEG-b-PLys-SGD/SA用Cy3预标记。在515nm的激发波长下记录光谱；

f）流式细胞仪定量分析DLNP，H2O2-NP和pH-NP的细胞内在化程度；

g）将DLNP（a），H2O2-NP（b）和pH-NP（c）在不同条件下与胶质瘤细胞共培养2 h的荧光显微镜图片。细胞骨架F-肌动蛋白和细胞核分别用若丹明鬼笔环肽（橙色）和4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）复染色。 标尺为40 µm；

h）在含有0％或10％血清的培养基中，不同条件下用DLNP，H2O2-NP和pH-NP转染的U87MG细胞的荧光显微镜图像。

图3 DLNP、H2O2-NP和pH-NP的生物功能表征

a–c）在不同条件下用DLNP处理的B16F10（a），GL261（b）和4T1（c）细胞的RNA变性凝胶。DLNP负载Cas13a/PD-L1；

d, e）在不同条件下用DLNP处理的B16F10（a），GL261和4T1（b）的细胞存活率。

图4 DLNP的体内抗肿瘤作用

a-c）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠的平均肿瘤生长动力学a），荷瘤小鼠的存活率b），以及小鼠的体重变化c）（n = 6）；

d-f）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠的肿瘤中肿瘤内的TNF-α（a），IFN-γ（b）和IL-2（c）水平；

g）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠体内肿瘤内CD8+ T细胞的流式细胞统计分析；

h）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠体内肿瘤内CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的流式细胞仪图；

i）肿瘤的代表性免疫荧光图像显示CD8+ T细胞和CD4+ T细胞浸润。标尺为100 μm。

图5 TME中DLNP的免疫反应分析

a，d）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠体内肿瘤内M2细胞的流式细胞仪图a），和统计结果d）；

b，e）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠体内肿瘤内M1细胞的流式细胞仪图b），和统计结果e）；

c，f）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠体内肿瘤内髓系抑制细胞的流式细胞仪图c），和统计结果f）；

g）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠的肿瘤中肿瘤内的IL-12水平。

图6 DLNP对CD8+T细胞缺失的B16F10荷瘤小鼠和4T1/B16F10共荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用的研究

a-d） DLNP处理的正常荷瘤小鼠及CD8+阻断荷瘤小鼠的平均肿瘤生长动力学a），存活率b），以及小鼠的体重变化d）；

c）肿瘤的代表性免疫荧光图像显示CD8 + T细胞和CD4 + T细胞浸润。 比例尺为100 μm;

e）4T1（右）和B16F10（左）共育C57BL/6小鼠示意图；

f）共负载小鼠的肿瘤生长曲线；

g）分别用PBS和DLNP处理的小鼠4T1和B16F10肿瘤中CD8+T细胞和CD4+T细胞的代表性流式细胞仪图。

【小结】

该研究开发了一种双锁纳米粒子，它可以限制CRISPR/Cas13a在肿瘤组织中的激活。采用聚乙二醇（PEG）为基的聚合物外壳，经静脉注射后，DLNP具有良好的血液循环稳定性。更重要的是，DLNP只能在低ph和高H2O2浓度的微环境中释放CRISPR/Cas13a系统。这一特性显著改善了CRISPR/Cas13a系统在肿瘤部位的富集，提高了CRISPR/Cas13a系统的基因编辑效率，减少了CRISPR/Cas13a在正常组织中的意外激活所引起的副作用。通过DLNP对CRISPR/Cas13a活化的精确控制，首次实现了CRISPR/Cas13a系统在肿瘤免疫治疗中的应用。

全身给药DLNP/Cas13a/PD-L1后，B16F10荷瘤小鼠的肿瘤生长速率显著减缓，生存率明显提高。因此，我们的研究为精确控制CRISPR/Cas13a系统激活抑制肿瘤生长提供了一种安全有效的方法。考虑到免疫效应细胞抑制途径的多样性，可以通过替换特异性crRNA的靶向基因而进行的进一步开发可能使DLNP成为快速开发安全有效的癌症免疫疗法的通用平台。

文献链接：Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy, 2019, Adv. Mater. DOI: 10.1002/adma.201905751.

团队介绍：

刘阳博士，研究员，2006年毕业于南开大学化学专业，获学士学位。同年考入南开大学高分子化学研究所，2011年毕业，获高分子化学博士学位。毕业后赴美在加州大学洛杉矶分校化学工程与分子生物工程系深造，于2016年获化学工程博士学位。主要从事高分子纳米药物载体及生物活性纳米材料的研究。代表性研究成果包括：建立了纳米复合酶的可控构建方法，实现了多种蛋白体内和胞内的协同递送；建立了多种可动态适应体内环境的纳米载体，显著提升了药物对肿瘤的富集效率；提出通过纳米-生物界面相互作用直接干预生物过程的新思路，构建多种具有生物活性表面的纳米颗粒，为癌症免疫治疗及阿尔兹海默症的治疗提供了全新的思路。相关成果在Nat. Nanotechnol. (1), Adv. Mater. (3), Nat. Commun. (1), Angew. Chem. Int. Ed. (2), Nano Lett. (2), Adv. Sci. (1) 等期刊发表论文40余篇。2016年入选中组部“青年千人”，2018年以首席科学家身份承担科技部重点研发计划“纳米科技”青年项目。

推荐文献：

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  2. East-Seletsky, M. R. O’Connell, S. C. Knight, D. Burstein, J. H. Cate, R. Tjian, J. A. Doudna, Nature 2016, 538, 270;
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