Advanced Materials：细菌分离和检测一体化的多级环形功能化碳纳米管阵列器件

一、【导读】

细菌污染及其产生的相关毒素可导致各种疾病与并发症，如伤口感染、食源性疾病、痢疾、败血症等，而快速准确的细菌检测是避免细菌污染和识别细菌来源的关键。然而，来源和成分复杂的各类生物样品固有的低病原体浓度和高杂质浓度为精准高效的细菌检测提出了巨大的挑战。为了解决样品中病原体浓度低的问题，目前细菌检测方法通常对样品进行额外的病原体分离富集和扩增的步骤。但是这种独立于检测步骤之外的预处理步骤存在耗时长、分析样本量小、以及需要专业器件和熟练人员等的制约，始终无法满足在突发公共卫生危机情况下对病原体的快速、现场和实时监测的需求。

近年来，具有超高孔隙度（>99%）和良好渗透率（1×10^-13 m²）的森林状碳纳米管阵列（CNTA）在细菌及其生物标志物的快速高效分离方面显示出了巨大的潜力。利用CNTA的三维纳米结构并用靶向分子对其进行功能化，可以实现在非牛顿流体样品中对粒度分布在0.04-100 µm之间的分析物的有效分离和特异性捕获富集。尽管已有研究在基于CNTA的微流控芯片中实现了对细胞、细菌、病毒等的高效分离，但其处理样本体积较小且尚未能实现集成分离和检测一体化的技术挑战。

二、【成果掠影】

近日，厦门大学材料学院李立煌博士等在任磊教授和王苗助理教授的指导下报道了一种基于适配体功能化的多级环形碳纳米管阵列器件。该器件在基于尺寸分离机制与适配体特异性捕获机制的共同作用下，实现了对复杂生物样品中的细菌及其生物标志物的快速分离和多靶标定量检测的一体化集成。并通过对离心力辅助调节CNTA内液体样品的流体动力学进行数值仿真计算研究，优化了该器件快速分离杂质和捕获生物标志物的性能（1 mL样品的处理时间为2.5 s），可以适用于各种不同体积的液体样品的快速检测分析（总体检测时间在30 min以内）。该工作以金黄色葡萄球菌及其外泌囊泡和肠毒素蛋白的检测为实例，展现了该集成化器件在多靶标病原体快速检测方面具备的宽检测限（10¹ ~ 10⁷ CFU/mL, R² = 0.997）、高灵敏度（LOD = 1.7 CFU/mL）、高特异性等优势。通过兔菌血症模型的检测分析中表现出的高效精确的检测结果，进一步表明该器件在复杂生物样品病原体检测中的巨大实际应用潜力。此外，该器件开放式的设计允许人们根据不同的应用场景对器件的检测层数和识别靶标进行定制，在突发传染病的诊断与治疗、感染源追踪、环境监测等领域具有重要的应用价值。该成果发表于材料领域国际顶级期刊Advanced Materials上。

三、【核心创新点】

其研究亮点在于利用CNTA尺寸分离机制、适配体识别机制以及离心力辅助流体流动机制设计了对病原体的快速精准分离和富集模块，并通过便携式拉曼检测模块实现了原位快速检测的集成。复杂生物样品无需任何预处理可以直接进行加样，在离心力的辅助下样品一次通过三种不同表面修饰的CNTA，其中大尺寸物质如细菌、细胞等在第一层环形CNTA中被滤出，小尺寸物质如外泌囊泡、蛋白、无机盐等可以在CNTA中顺畅流动。器件后续几层环形CNTA可以根据检测需求进行相应适配体修饰的定制，以实现对特定生物标志物的捕获。在各个环形检测层上被分别分离和富集的病原体通过适配体修饰的表面增强拉曼散射（SERS）标签进行二次捕获，形成三明治SERS检测模型用于原位快速拉曼信号的检测。

通过流体动力学数值仿真分析，团队系统性地探究了离心力作用下器件中液体样品的流动性以及微观粒子与CNTA的相互作用关系。通过多孔介质两相流的数值模拟，团队引入离心力来改善样品在器件中流动性，克服了样品在器件中非均匀流动甚至外溢的问题，在保证病原体分离效率的同时提高样品添加速率以便于缩短大体积样品的总体检测时间。通过流体动力学与粒子跟踪的数值模拟，团队揭示了微观粒子在流经CNTA过程中由于近表面效应增加了流体中粒子与适配体修饰的CNTA的接触时间，粒子在阵列中的滞留时间的延长为提高适配体的特异性结合效率提供了条件。

以金黄色葡萄球菌及其外泌囊泡和肠毒素蛋白的检测为实例，团队建立细菌浓度与SERS信号强度之间的线性关系，结果表明在10¹ - 10⁶ CFU/mL浓度范围内，基于不同生物标志物的SERS信号强度均与细菌浓度呈现出良好的线性关系。在使用含有金黄色葡萄球菌的兔血样本检测中，对各个环形检测层上36个取样点的SERS检测信号热图都表现出均匀的强度分布和低信噪比，且该结果与传统血培养计数法的结果无明显差异，表明该器件定量检测的可靠性。团队以大肠杆菌、罗伊氏乳杆菌和铜绿假单胞菌为对照，表明该器件具有良好的特异性。此外，通过对兔菌血症模型的外周血液样本检测表明该器件可以快速有效地鉴定出兔外周血样品中中低浓度细菌，表明了其在菌血症、脓毒症等严重细菌感染疾病诊断中的实际应用潜力。

四、【数据概览】

图1、集分离和检测一体化的多级环形功能化碳纳米管阵列器件示意图

图2 碳纳米管阵列器件和表面增强拉曼散射标签的制备。（A）多级环形功能碳纳米管阵列器件制备示意图；（B）碳纳米管和（C）经层层自组装修饰的碳纳米管电镜图；（D）层层自组装修饰的碳纳米管阵列的水接触角；（E）层层自组装修饰的碳纳米管阵列的红外光谱图；（F）荧光标记适配体功能化修饰的碳纳米管阵列三维共聚焦图像；（G）基于金纳米棒的表面增强拉曼散射标签的透射电镜图；（H）聚集状态下表面增强拉曼散射标签的拉曼增强因子模拟；（I）表面增强拉曼散射标签的拉曼光谱图。

功能化CNTA的制备方法如图2A所示，超疏水的CNTA通过层层自组装（LBL）进行亲水性修饰，并以生物素-亲和素系统介导了CNTA与不同适配体的功能化。化学气相沉积制备的CNTA呈现出典型的森林状结构（图2B），经功能化后其表面组装了厚度约为3 nm的聚合物层（图2C）。表面修饰后的CNTA的亲水性显著提高（图2D），从而便于液体样品的快速流动。红外光谱（图2E）和激光共聚焦荧光分布（图2F）进一步表明CNTA成功实现了均匀的表面功能化修饰。由于在CNTA表面引入了丰富的适配体，该器件表现出对外泌囊泡和肠毒素的特异性捕获能力。为了获得高灵敏度的检测信号，制备了基于金纳米棒的SERS标签（图2G），并通过数值仿真计算了其聚集状态下的最大电场增强（EFmax）可达6.82 × 10⁸（图2H）。位于SERS标签聚集体产生的热点区域内的DTNB分子提供了金黄色葡萄球菌表面蛋白A靶向的SERS标签（SSA-SERS标签）和金黄色葡萄球菌肠毒素蛋白靶向的SERS标签（SEA-SERS标签）的高强度SERS信号，为后续的高灵敏度定量测定提供了基础（图2I）。

图3、离心力辅助的流体动力学模拟。不同转速下多级功能化碳纳米管阵列器件的流体形态（A）示意图和（B）实时照片；（C）不同转速对应压力下的多孔介质两相流仿真计算；（D）液相填充碳纳米管阵列所需的时间与压力的关系；（E）碳纳米管阵列内的液体流速分布；（F）单根碳纳米管表面液体流速；（G）微观粒子流经碳纳米管阵列的轨迹仿真；（H）流体与碳纳米管阵列相互作用下微观粒子的滞留时间。

保证液体样品在器件中的快速均匀流动是提高细菌分离效率的前提。虽然功能化后的CNTA具有良好的亲水性和渗透性，但当样品添加速率较高时，由于液体的表面张力，液体更容易从器件中溢出。为了克服液体溢出的问题，团队提出了通过离心力辅助增加液体流动性的解决方案（图3A）。利用器件在旋转时产生的离心力，液体样品可以以较高的注射速度均匀地流过CNTA而不引起外溢（图3B）。进一步地，通过流体动力学数值仿真计算，系统性地探究了离心力作用下器件中液体样品的流动性（图3C-D）以及微观粒子与CNTA的相互作用（图3E-H）。结果表明，在离心力的辅助下样品在CNTA中的流动速度显著加快避免了液体的外溢。此外，CNTA近表面流体速度降低的效应有助于增加流体中粒子与CNTA表面相互作用的相对时间，这种粒子滞留时间的延长为提高靶分子的特异性捕获效率提供了条件。

图4、金黄色葡萄球菌及其外泌囊泡和肠毒素分离和检测性能的集成。（A）基于尺寸分离的碳纳米管阵列工作示意图；（B）分离富集在碳纳米管阵列中的金黄色葡萄球菌的扫描电镜图；（C）器件在不同转速下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、兔红细胞、胎牛血清蛋白和葡萄糖的过滤性能；（D）表面增强拉曼散射标签介导的拉曼信号检测示意图；（E）表面增强拉曼散射标签对分离富集在碳纳米管阵列中的金黄色葡萄球菌进行二次捕获的扫描电镜图；一系列细菌浓度梯度下对（F）金黄色葡萄球菌、（G）外泌囊泡和（H）肠毒素的拉曼光谱图；（I）多级环形功能化碳纳米管阵列器件对金黄色葡萄球菌、外泌囊泡和肠毒素检测信号的线性拟合。

该器件通过CNTA尺寸分离机制和修饰适配体的特异性捕获机制来实现细菌及其生物标记物的分离富集，进而在器件上实现原位快速的拉曼检测模块的集成。在第一层环形CNTA上，大尺寸物质如细菌、细胞等被滤出，小尺寸物质如外泌囊泡、蛋白等可以顺畅流动到相应的适配体修饰CNTA上被捕获（图4A-C）。分离富集在CNTA上的细菌生物标记物与适配体修饰的SERS标签实现二次结合形成三明治SERS检测模型（图4D-E）。以金黄色葡萄球菌为模型菌，团队建立了细菌浓度与SERS信号强度之间的线性关系（图4F-I）。结果表明在10¹ - 10⁶ CFU/mL浓度范围内，基于不同生物标志物的SERS信号强度均与生物标志物浓度呈良好的线性关系，最低检测限为1.7 CFU/mL。

图5、多级环形功能化碳纳米管阵列器件对复杂生物样品的检测性能。（A）在器件环形区域中各选择36个随机检测点的检测信号强度热图；（B）使用器件和传统血培养计算法对含菌的兔外周血样本的检测结果；（C）多级环形功能化碳纳米管阵列器件的特异性；（D）兔菌血症模型和正常兔的血液检测结果。

为了进一步验证该器件的实用性和可靠性，团队使用该器件对未经任何前处理的血液样本进行了加标检测，器件上三层标志物的SERS检测信号热图呈现出均匀的强度分布和低信噪比（图5A），表明定量检测的可靠性。根据浓度的线性关系将SERS信号强度转换为细菌浓度后，该器件的三层独立检测结果与传统血培养计数法无明显差异（图5B）。以大肠杆菌、罗伊氏乳杆菌和铜绿假单胞菌为对照，团队考察了该器件的特异性（图5C）。此外，通过兔菌血症模型与正常兔的外周血检查结果表明该器件可以快速有效地诊断出菌血症以及感染的细菌种类（图5D），表明了其在复杂生物样品检测中的巨大潜力。

五、【成果启示】

该团队的研究成果为高效检测各类复杂生物样品中病原体含量和种类的检测提供了全新的解决方案，在快速、高灵敏度、多标记和定量的病原体实时检测技术方面取得了重要进展。该研究不仅为基于CNTA的快速样品分离富集应用提供了理论指导，也为各种病原体快速痕量检测以及大体积样本实时监测等方面提供了技术思路。

文章信息：

Lihuang Li, Jialing Zhang, Zhengqi Jiao, Xi Zhou, Lei Ren, Miao Wang. Seamless Integration of Rapid Separation and Ultra-Sensitive Detection for Complex Biological Samples using Multistage Annular Functionalized Carbon Nanotube Arrays. Advanced Materials 2024, 2312518. DOI: 10.1002/adma.202312518

文章链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202312518

作者简介：

李立煌，厦门大学厦门大学材料学院博士研究生，2019年于厦门大学获得硕士学位，研究方向主要为数值仿真、生物传感器、仿生器件等。

王苗，厦门大学助理教授，福建省高层次人才，中国化学快报《Chinese Chemical Letters》青年编委。已发表学术论文57篇，其中以第一/通讯作者在Adv. Mater., Joule, JACS, Nano Lett., ACS Nano, Adv. Funct. Mater.等高水平学术期刊上发表论文35篇，合作发表Nature，Nat. Commun., Sci. Adv.等顶级期刊论文；主持国家自然科学基金、福建省自然科学基金及高校-企业合作横向课题等共计7项；授权专利13项；曾入围MINE2020青年科学家候选人；2023年获得第十五届福建省自然科学优秀学术论文。

任磊，厦门大学教授、博士生导师，《Journal of Functional Biomaterials》、《Smart Materials in Medicine》等期刊编辑。近年来任磊教授长期坚持致力于从事纳米靶向药物、纳米免疫制剂、纳米材料合成、生物传感器和仿生器件等方面的研究工作。目前已主持多项国家自然科学基金等国家级项目，并与多家生物医药企业开展转化合作研究，已发表学术论文170余篇；获授权中国发明专利20余项。