食品安全检测新材料︱上转换发光材料

基于荧光共振能量转移的上转换NaYF4:Yb,Er传感器检测葡萄糖

上转换发光技术又称UPT（upconverting technology），是基于上转换发光纳米颗粒（upconverting nanoparticles，UCNPs）的一种新兴技术，其本质为反斯托克斯发光。由斯托克斯定律而来，斯托克斯定律认为材料只能受到高能量的光激发，而发出低能量的光，换句话说，就是波长短、频率高的光激发出波长长、频率低的光。但是后来人们发现，有些材料可以实现与上述定律正好相反的发光效果，即可以将低能量的红外辐射变为高能量的近红外辐射或可见光辐射。于是我们称其为反斯托克斯发光，又称上转换发光。因其独特的光学和化学特性而备受国内外专家学者的关注。

UCNPs即上转换发光纳米颗粒，主要是指掺杂了稀土元素的固体化合物，可以通过吸收两个或多个（长波长）低能光子而发射出一个（短波长）高能光子，是一个非线性的光学过程，其在近红外光源的激发下，可以发射出短波长的光，其范围可从紫外光到近红外光。UCNPs通常由基质材料、激活剂、敏化剂组成。利用稀土元素离子亚稳态的能级在光激发过程中发生反斯托克斯效应。

UCNPs之所以会受到国内外专家学者的青睐是因为其具有如下其他物质所不可替代的优势：首先，UCNPs有非常好的光学特性。这使得其能够在光学生物成像中有多种显著的特点，如极弱的背景荧光、大的反斯托克斯效应，窄的发射带宽、不易光漂白、荧光稳定、更少的光散射和更深的组织穿透力。尤其是这些纳米粒子的荧光稳定且不闪烁特点，使得其能够更好地应用于体内或体外的跟踪治疗。其与生物体内细胞荧光素重叠的光谱被减到最低，这使得在细胞成像中存在了零背景荧光干扰。因此，这种发射可见光（蓝、绿、红）的UCNPs已经被用于细胞多色成像、浅组织成像和透射生物体。UCNPs是由近红外光激发的，又可以发射近红外光，因此，其在体内成像时可以有较少的光散射和较深的组织穿透能力。

荧光成像技术是通过光激发荧光探针进行成像，相比于其他技术具有价格低廉、分辨率高、灵敏快速的优点。有机染料和荧光蛋白是最早使用也是最常使用的生物发光探针，其量子产率高，粒径小，生物相容性好，易于表面修饰，相对于其他荧光探针有着天然优势，但其稳定性差、斯托克斯位移小、发射峰宽、容易被光漂白等缺点极大地限制了其应用，而UCNPs能够很好地克服上述生物发光探针在成像中的不足；随后发展的半导体荧光纳米晶体和无机量子点的光稳定性好，发射峰窄且峰位置可控，克服了传统有机荧光染料的部分缺点，扩宽了荧光探针的应用范围，然而也存在间歇性荧光发射（“光闪烁”现象）和潜在的生物毒性等局限。上述传统的生物标记材料（有机染料、荧光蛋白、半导体纳米晶体、无机量子点等）多使用短波长的紫外光或可见光作为激发光源，因此在应用于生物组织过程中存在普遍问题：①短波长激发光对生物组织的穿透性差；②长时间照射引起的组织损伤和细胞死亡；③生物组织在短波激发下有自发荧光产生背景噪音干扰成像结果。因此研发出能克服传统生物标记探针缺点，更为有效的新型荧光材料尤为重要。显然，UCNPs能很好地克服传统材料的不足。

第二，UCNPs有非常好的化学特性，可以很好地结合治疗因子。单分子的UCNPs颗粒形状、大小可控且具有较大的比表面积，故而可以很好地结合药物或目标配体。UCNPs与载体既可以由非共价键进行偶联也可以由共价键进行偶联。此外，其纳米粒子表面可以进行调整来使其有多种配位功能，由此可以提供一个有效的药物输送系统以确保细胞摄取和载体释放和目标细胞定位。

最后，UCNPs也有着很好的生物相容性，因为其不包含有毒的化学元素，这使得其具有潜在的生物医学应用价值且在生物传感和活体成像方面的作用也已经被描述出来。

上转换发光材料的合成机理

在过去的几年中，人们对上转换材料的发光机制已经有了深入研究。上转换过程是由低能量的电子激发而产生高能量发射的非线性过程，由于过程为双光子或多光子过程，违背斯托克斯定律，因而也称为反斯托克斯过程。其机制可分为三大类：激发态吸收（excited state absorption，ESA）、能量转移（energy transfer，ET）和光子雪崩（photon avalanche，PA）。下图为几种上转换发光过程示意图。

上转换发光机制示意图

激发态吸收：即为同一离子吸收两个光子，是唯一一种发生在低浓度稀土掺杂材料中的过程。第一个光子使离子从基态进入到一个稳定的中间激发态（即基态吸收，GSA），第二个光子将离子从中间态激励至更高的激发态,最后激发离子回落基态而产生上转换发光。也存在稀土离子一次性吸收两个光子的双光子激发过程（TPAE）。

能量转移：发生在有敏化剂掺杂的材料中，敏化剂被激发后回落至基态，能量转移给邻近的激活剂离子。能量吸收过程通常发生在高浓度稀土离子掺杂的材料中，且可与激发态吸收同时存在，可分为能量转移伴随激发态吸收（EFE）、连续能量转移（APTE）、交叉弛豫（CR）、合作上转换发光（COL）、合作敏化（COS）等常见类型。

光子雪崩（PA）：也成为吸收雪崩，是产生发光效率最高的机制。首先敏化离子吸收光跃迁至第一激发态，而后再次吸收入射光子跃迁至第二激发态。处于第二激发态的敏化离子可以与邻近的基态离子发生交叉弛豫产生两个处于第一激发态的敏化离子，这两个敏化离子又可以再次吸收光子重复此过程产生四个激发态敏化离子，由此如雪崩般积累产生大量处于中间激发态的敏化离子而储存大量能量。

上转换发光材料的合成方法

上转换材料中的敏化剂离子和发光中心——激活剂的成分和掺杂比例对材料的发光效率起到了决定性的影响，大多数上转换材料中敏化剂的掺杂量大约为20%（摩尔分数），而激发剂小于2%（摩尔分数）。掺杂的稀土离子Ho³⁺、Nd³⁺、Tm³⁺、Er³⁺等拥有丰富的能级，由于受4f能级外层的电子屏蔽作用，能级寿命较长。稀土离子Yb³⁺的激发波长是980nm，与Er³⁺第一激发态的吸收能量一致，且吸收截面远大于Er³⁺，因而是一种很有效的敏化剂。无机化合物基体为激活离子提供适合的晶体场，且需要对入射光基本无吸收，声子能量低以便最大限度降低非辐射损失，提高稀土离子上转换过程的效率。在诸多材料中，氟化物由于其低的光子能量和高的化学稳定性，是最为理想的基体材料。如Yb³⁺/Er³⁺和Yb³⁺/Tm³⁺掺杂的NaYF₄是最高效的产生蓝色和绿色发光的材料。NaYF₄在常压下有两种结晶态，α相-立方晶系和β相-六方晶系，β-NaYF₄为基体的材料发光效率远高于α-NaYF₄的材料，所以对基体晶型的控制也是必不可少的合成环节。

上转换纳米粒子不同于量子点，其能级的转化主要定域于敏化剂和激活剂之间，通过偶极或者其他相互作用改变传递能量，不显示量子定域效应，故不需要像合成量子点时一样对粒径进行严格掌控。而反应物的均一分散和比例优化、对稀土元素氧化态的控制是制备过程中的重点。激光蚀刻法和消解法可以从块体材料得到相应的纳米颗粒，但是很难实现对粒径和分散性的掌控。相对于上述物理法，化学法是更好的合成路径，如共沉淀法、溶胶凝胶法、热分解法、水热合成法等。

共沉淀法

合成条件温和，设备易得，易于操作，是合成上转换材料最简单且方便的方法。合成的上转换纳米颗粒粒径分布均匀且粒径可控。Yi等首先提出了在EDTA辅助共沉淀法合成NaYF₄:Yb,Er，方法为将稀土离子-EDTA复合物迅速加入NaF溶液中并剧烈搅拌。通过均相成核过程生成了α相的NaYF4:Yb,Er纳米颗粒，通过改变EDTA和稀土元素的比例可将粒径控制在37～166nm。由于α相的纳米颗粒上转换发射太弱，需要退火使α相NaYF₄转变为β相，上转换荧光可增强40倍左右。共沉淀法的缺点是产物结晶程度低。

溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法是制备溶液前驱体，经过溶胶进而转变为凝胶，而后经焙烧热处理取出有机成分，这种方法难以控制纳米颗粒的形状和粒径，所以难以达到单分散的纳米颗粒，而且产物经常会掺杂炭颗粒污染物。另外溶胶-凝胶法还能用于合成氧化和氢氧化纳米材料。经过改进的溶胶-凝胶法可通过使用金属醋酸盐三氟乙酸制备掺杂Eu³⁺离子的CaF₂纳米颗粒，首先将Ca(OH)₂和Eu(CH₃COO)₃·4H₂O溶解于去离子水和乙醇混合物中，用三氟乙酸超声1h,得到的沉淀在100℃干燥24h并高温陈化，将温度升高至700℃调整实现使粒径从15～200nm的增加。

热分解法

热分解法的原理是金属四氟醋酸盐可热分解形成相应的金属氟化物。因此热分解反应步骤为：将溶剂和金属四氟醋酸盐置于三颈瓶中，剧烈搅拌后加热至100℃除去水和氧气得到透明溶液，继续在氩气的环境中加热到250～330℃。将过量的乙醇导入溶液中，沉淀物经过离心与液相分离，洗涤后烘干即可得到目标产物。近些年来热分解法经过不断完善，改变反应物类型、比例，使用新型溶剂和优化加热程序，可得到满意的上转换纳米材料。尽管热分解法被证实为一种有效的合成单分散、结晶度高、粒径均一和纯净的上转换纳米颗粒的方法，但是仍有一些不足，诸如合成条件苛刻、时间长、温度高，合成过程中会产生有毒物质等。

水热合成法

水热反应指在密闭的高温高压环境中进行的合成步骤，基于反应原料在高温高压下在水中的高溶解度，使溶解在液相中的物质形成结晶，反应过程不需要使用毒性高的有机溶剂，相对于热分解法更加绿色友好。典型的水热反应是在一种特制的反应容器——反应釜中进行的。Song等设计的水热反应合成步骤如下：将总量为0.5mmol的稀土氧化物（0.325mmolY₂O₃+0.075mmolGd₂O₃+0.09mmolYb₂O₃+0.01mmolEr₂O₃）溶解于10mL、10%的盐酸溶液中，而后将溶液蒸干得到稀土氯化物粉末，然后加入含有0.5g PVP的10mL乙二醇将粉末溶解，机械搅拌呈均一溶液。再快速加入16mL含有0.302gNaF的乙二醇溶液，搅拌10min后转移至30mL水热反应釜中于220℃密闭充分反应，冷却至室温，离心机收集沉淀用去离子水和乙醇洗涤，最后用真空干燥箱干燥24h。此方法合成了粒径为40～100nm的NaYF₄:Yb,Er纳米颗粒，优化反应时间和配比可得到亲水性强、发光效率高的优良上转换荧光材料。

水热反应合成高质量的上转换纳米颗粒有以下优势：①产物十分纯净；②容易控制颗粒的粒径结构和形态；③相对低的反应温度；④操作过程使用设备简单。但由于水热合成法的限制在于生成的纳米颗粒表面大多都存在疏水基团，所以需要后续的修饰增加水溶性。

其他方法

SK Singh等报道了一种水相的脉冲激光蚀刻法，合成纳米球的形状尺寸可控，不用加入任何表面活性剂即可溶解形成透明溶液。这种激光蚀刻法的优势在于可以得到粒径分布均匀、孔隙率低、杂质少晶格缺陷率低、化学成分复杂的上转换纳米材料。首先用溶液燃烧法合成Er³⁺、Yb³⁺掺杂的Gd₂O₃荧光团，将合成的块体荧光团浸没于溶液中，用频率10Hz的第三谐振（355nm）的脉冲辐射，在辐射过程中不断翻转以避免在块体表面形成孔洞，并不断搅动溶液防止自吸效应。该方法合成了粒径在8～26nm的纳米球，并在溶液中形成透明分散的溶胶，溶胶显示出多种颜色的可见上转换荧光，可以用于生物成像和标记。另外还有微乳法、固体模板法等。

目前，UCNPs在合成、修饰和应用方面取得了突飞猛进的发展，特有的光学特性及高度的可调性使得这些材料成为了诱导成像、药物传送、靶向应用和生物传感等领域中具有很大潜力的材料。虽然取得了很大的进步，但是依然存在很多问题有待我们解决。例如，①我们使用的一些UCNPs在980nm的吸收峰与水的吸收峰是重叠的，这就造成了不利于进行成像研究的热效应。因此，这就需要研究一种新的发射波长在700～900nm的UCNPs。②关于活体成像和药物传送中，要想利用一个有效的尿排泄来把体内的纳米颗粒移除到体外，需要把纳米颗粒的尺寸控制在6nm之内。然而，缩小UCNPs的尺寸后，往往导致其发光效率变低，因为其表面的荧光猝灭效应是由尺寸决定的。因此，单分散性的小尺寸纳米结构且发射强荧光的UCNPs的新的设计及合成方法也是需要研究的。③一般的显微镜和活体成像系统需要被个性化制作来使其适应UCNPs特有的激发和发射特性。因此，商业设备及系统的发展对加快UCNPs的应用有至关重要的作用。

况且，系统的研究成像方法和药物传送理论特性，如吸收率、释放率和毒性，将会为这些纳米颗粒在体内的最优化应用提供较为深刻的分析基础。同样重要的是，这些研究将会为解释细胞对纳米颗粒的吸收机制提供较为深刻的理论基础。最后，靶标传送方法的创建很大程度上提高了我们对灵敏性疾病，如癌症和HIV的治疗水平。

另外上转换材料已在疾病检测等方面取得巨大成功,但在检测食品中农药、兽药残留方面研究尚少。将上转换技术与酶联免疫技术、胶体金技术联合起来，实现对目标物的快速灵敏检测，在食品安全与卫生、医学检测等方面有重大的意义。

本文由安静摘编自高志贤主编《食品安全快速检测新技术及新材料》之第十章。

《食品安全快速检测新技术及新材料》论述了食品安全快速检测的新技术以及新型材料在食品安全检测中的应用。其中，食品安全检测技术包括电化学、电化学发光技术、石英晶体微天平、表面等离子体共振、量热传感技术、悬浮芯片、核酸适配体技术等技术原理及其在食品安全检测中的应用；新材料包括磁性纳米材料、量子点及上转换发光材料与光子晶体材料的合成技术及其在食品安全中的应用研究。

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