苏州大学高明远教授团队JACS:双比率荧光探针实现活体MMP-9和pH变化的实时监测


【引言】

近来,肿瘤微环境在肿瘤的复发和转移中的作用受到肿瘤研究者的高度关注。肿瘤微环境中充斥着大量诸如基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白酶类家族,MMPs不仅和肿瘤转移相关,还与细胞凋亡、血管生成、肿瘤生长有关。通常MMPs的检测是利用小组织活检或体内荧光等方式,小组织活检不能完全反应MMPs在肿瘤中的整体分布,体内荧光方式不能提供MMPs表达的定量信息。

在肿瘤微环境中除了MMP的异常表达外,由葡萄糖代谢改变和葡萄糖摄取增加引起的pH值降低也是肿瘤的另一个重要特征。然而常用的pH响应性荧光探针通常会受到许多外界因素的干扰,而影响活体肿瘤pH的检测。相比之下,比率型荧光探针可以很好的缓解外界干扰,并可实现pH的定量检测。然而,目前研究的成像探针仅可用于肿瘤微环境单一方面异常因素的检测,但与肿瘤相关的异常改变通常是多方面并且相互之间是强烈相关的。因此,对于可同时检测肿瘤相关蛋白酶(如MMPs)和细胞外pH值的探针的研究成为当下亟待解决的研究热点。

【成果简介】

近日,苏州大学高明远教授(通讯作者)团队在JACS在线发表了一篇题为“Dual-Ratiometric Target-Triggered Fluorescent Probe for Simultaneous Quantitative Visualization of Tumor Microenvironment Protease Activity and pH in Vivo”的文章,介绍了一种双比率荧光探针,实现了MMP-9过表达和肿瘤微环境pH异常的定量可视化,阐明其空间异质性并且协同的指示了体内肿瘤入侵过程。该研究最大的创新点在于通过无创伤多模态成像对多种肿瘤微环境特征信号进行定量和实时检测。研究者对所设计探针一般概念的展示可能为体内异常肿瘤特征研究提供了一种强有力工具。

【图文导读】

示意图 静脉注射纳米探针后探针通过受损血管进入肿瘤组织

纳米探针一旦进入肿瘤组织内,MMP-9将对连接ANNA(pH敏感的荧光染料)与Fe3O 4纳米颗粒连接的肽接头进行切割,使ANNA的荧光得到活化。通过比较ANNA的可变激活发射和Cy5.5的恒定荧光,可以对MMP-9活性进行量化并作图。在这种设计中,Fe3O 4颗粒载体不仅作为ANNA的猝灭剂,而且还作为肿瘤的磁共振成像(MRI)的造影剂。

图1. 纳米探针的系列表征             

a) 纳米探针结构示意图

b) Fe3O 4纳米颗粒的TEM表征

c) Fe3O 4纳米颗粒的的UV-vis-NIR光谱

d) 质子化/去质子化诱导的ANNA结构转变;Cy5.5的化学结构;不同pH下ANNA和Cy5.5的荧光光谱图。

图2. 纳米探针的体外荧光表征

a) 纳米探针与激活的MMP-9作用不同时间后在455 nm和650 nm激发下的荧光光谱

b) ANNA(绿色)和Cy 5.5(红色)荧光峰值强度随时间的变化

c) 纳米探针与浓度的MMP-9共孵育后的荧光光谱

d) 固定孵育时间为30分钟,ANNA和Cy5.5(IANNA / ICy5.5)的积分发射强度比率与激活的MMP-9浓度之间的线性关系(线性拟合结果显示体外MMP-9的检测极限为0.74nM,置信水平为99.9%)

e) 纳米探针孵育6小时后LS180细胞(顶行)和人成纤维细胞(对照细胞(底行))的共聚焦显微镜图像,根据染料的不同发射波长用不同的通道成像(细胞核:Hoechst染色,标尺为10μm)。

图3. 荷瘤小鼠荧光成像和MR成像表征

上图:荷瘤小鼠相应明场图像上的肿瘤部位Cy5.5和ANNA信号变化的荧光图像(右框1-9:心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肠道,骨骼,肌肉和肿瘤等)。

下图:静脉注射纳米探针之前和注射后不同时间点获得的荷瘤小鼠的T2加权MR图像颜色编码图(右框:具有类似结构的不含FA的纳米探针的T2值随时间变化作为对照)。

4. MMP-9pH值的体内成像图

a-b) MMP-9在体内活性强度的等高线图和肿瘤部位的pH值(白色虚线表示组织分析得到的肿瘤横截面)

c) 三个相邻组织的H&E切片以及普鲁士蓝染色。

5. MMP-9pH值的相互关联分析

a) 瘤内注射PBS(pH 6.2)调节肿瘤pH后MMP-9活性的变化

b) 通过比色测定(左)获得的MMP-9的定量表达水平和多模态成像(中)获得的相对MMP-9活性,以及使用ANNA荧光发射(右)量化的肿瘤微环境pH

c) 在D + 0,D + 2和D + 4获得的肿瘤的定量pH和MMP-9表达图谱(在从黑色到黄色的颜色条阴影中,用于读取MMP-9表达水平,每个格对应0.25个单位)

d) 4天内皮下肿瘤的生长照片

e) 上图:H&E染色的组织载玻片的显微图像; 下图:两个相邻载玻片用E-钙粘蛋白染色(红色)和MMP-9表达(绿色)(标尺:200 μm)的免疫荧光显微图像的组合。橙色箭头指向健康组织和MMP-9高度表达的肿瘤组织之间的分界线。

【小结】

基于FRET系统成功构建了一种蛋白酶触发的双比率型荧光探针,这个探针包括Fe3O4纳米粒子,pH敏感的比率型荧光染料(ANNA),近红外染料(Cy5.5),MMP-9特定的肽底物接头,和肿瘤活性靶向部分叶酸(FA)。系统的研究进一步表明双比率测量系统不仅提供肿瘤中MMP-9局部蛋白酶的活性和pH的实时信息,并且可对信息进行量化。目前的研究还表明MMP-9的过度表达在时间和位置上都与体内异常的pH有很好的相关性。这两个特征的协同效应是决定恶性肿瘤异质侵袭的主要因素。这一研究为后续肿瘤相关的蛋白酶及细胞外较低的pH值的肿瘤微环境与肿瘤侵袭、增殖和转移之间的联系提供了新的研究思路和方法。

 文献链接:Dual-Ratiometric Target-Triggered Fluorescent Probe for Simultaneous Quantitative Visualization of Tumor Microenvironment Protease Activity and pH in Vivo(J. Am. Chem. Soc.,2017,DOI: 10.1021/jacs.7b08900)

本文由材料人编辑部南渡编译,刘宇龙审核,点我加入材料人编辑部

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