浙江大学刘建钊课题组和唐本忠、孙景志课题组Anal. Chem.:诊疗型AIE探针在对肿瘤辅助巨噬细胞的特异性识别、成像和光动力学治疗中的应用

【引言】

肿瘤细胞存在于复杂的微环境中。这种微环境包含血管，免疫细胞，骨髓来源的炎症细胞，淋巴细胞，信号分子和细胞外基质。在肿瘤部位的免疫细胞中，巨噬细胞特别丰富。他们存在于肿瘤生长的所有阶段。与其他细胞不同，巨噬细胞是高度极化的，并且可以通过局部微环境刺激从M0阶段极化到不同的亚型，即M1和M2。M1和M2巨噬细胞表现出截然不同的功能。经典的M1巨噬细胞可以增强免疫反应并抑制肿瘤生长；而M2巨噬细胞抑制抗肿瘤免疫应答并促进肿瘤生长和血管生成，称为肿瘤辅助巨噬细胞（TAMs）。有越来越多的生物学研究证据表明TAMs是癌症治疗的靶点。

基于之前的研究，TAMs的特异性识别和消除是提高癌症治疗效率的有效方式。 目前对TAMs的识别主要依赖于传统的生化手段，比如qRT-PCR，蛋白质印迹和生物标记物的免疫荧光染色。这些生物技术通常依赖于耗时的程序，昂贵的仪器和生物试剂，限制了其在快速体内检测中的应用。TAMs的治疗主要利用化学药物，但是化学治疗的疗效通常受到耐药性问题的限制。此外，最近的研究还表明，TAMs还与癌细胞的抗药性相关。因此化学疗法不是消除TAMs的有效方法。因此需要开发用于识别和消除TAMs的替代方法。

光动力疗法（PDT）使用光敏剂来实现其治疗目的，并具可以有效克服耐药性问题。光敏剂通过光照活化并产生活性氧（ROS），杀死恶性细胞。大多数光敏剂具有光致发光特性，能够在生命系统中以高分辨率跟踪特殊细胞或细胞过程。原则上，光敏剂可以设计成同时具有细胞成像和消除的双重功能。然而，传统光敏剂通常具有平面结构，倾向于通过π-π堆积形成聚集体并且遭受聚集引起的荧光猝灭（ACQ）。聚集不仅导致猝灭荧光，还导致ROS产率降低。 为了解决这些问题，科研工作者已经做出许多努力来解决ACQ光敏剂的聚集问题，但是成果很有限。

最近，具有聚集诱导发光（AIE）特征的荧光团引起了广泛的研究关注。与ACQ染料不同的是，AIE染料（AIEgens）是一系列具有螺旋桨形状的分子。当AIE染料以单分子形式溶解时，它们是不发光的；但当其形成聚集体时，由于分子内运动受限（RIM）而导致荧光增强。与ACQ染料相比，AIEgens通常具有更大的斯托克斯位移，并且可以容易地设计为用于具有高信噪比成像的点亮型探针。同时，AIEgens比ACQ染料具有更好的耐光漂白性，因为它们在聚集状态可以具有更高的工作浓度。此外，AIE光敏剂在聚集状态下显示出较高的ROS产率，并广泛应用于成像辅助的光动力学治疗中。

【成果简介】

近日，浙江大学刘建钊教授课题组、唐本忠院士和孙景志教授课题组、新加坡国立大学刘斌教授课题组合作设计并合成了一种诊疗型AIE探针，即TPE-Man，应用于TAMs的靶向成像和光动力学治疗中。TPE-Man由具有红光发射的AIE光敏剂和可以特异性靶向TAMs的α-甘露糖苷组成。TPE-Man显示出对TAMs的优异靶向特异性，这归因于甘露糖和CD206之间的特异性相互作用。通过流式细胞仪分析和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像确定成像的特异性。此外，TPE-Man应用于组织切片成像，并显示与商业抗体免疫染色具有显著的信号重叠，表明探针具有疾病诊断的潜力。在暴露于可见光照时，细胞内的TPE-Man产生ROS可以有效地杀死TAMs。该成果以题为“Specific Targeting, Imaging, and Ablation of Tumor-Associated Macrophages by Theranostic Mannose-AIEgen Conjugates”发表在Anal. Chem.上。

【图文导读】

Scheme 1.TPE-Man探针在对肿瘤辅助巨噬细胞的特异性识别、成像和光动力学治疗中的应用

Scheme 2.M0和TAMs的培育示意图

Figure 1.滴定实验

(a,d).TPE-Man和TPE-Gal分别对Con A和PNA的浓度响应

(b,e).I/I₀-1随凝集素浓度的变化

(c,f).TPE-Man和TPE-Gal对Con A和PNA的特异性

Figure 2.TPE-Man对TAMs的特异性识别

(a).qRT-PCR对M0和TAMs中标记物含量的测定

(b).TPE-Man和TPE-Gal分别对M0和TAMs的成像

(c).用TPE-Man分别处理M0和TAMs后的流式细胞仪分析

Figure 3.TPE-Man对TAMs上CD206的特异性识别

(a-c).不同浓度甘露糖预处理TAMs后的荧光成像

(d-f).不同浓度甘露糖预处理M0后的荧光成像

Figure 4.TPE-Man对TAMs的特异性识别

(a).TPE-Man的吸收和发射光谱

(b,c).TPE-Man和商业染料的光稳定性对比

Figure 5.TPE-Man与免疫荧光的信号对比

Figure 6.TPE-Man对TAMs的光动力学治疗

(a).TAMs负载不同浓度的TPE-Man的细胞存活率

(b-d).TAMs负载不同浓度的TPE-Man的活死细胞染色

【小结】

在这个工作中，作者设计合成了一种甘露糖修饰的AIE荧光探针（TPE-Man），可用于TAMs的靶向性成像和光动力学治疗中。TPE-Man是由发红色荧光的AIE光敏剂和两个可以特异性靶向TAMs表面膜蛋白的α-甘露糖苷组成。α-甘露糖苷可以特异性靶向CD206（也称为甘露糖受体蛋白），而CD-206在TAMs细胞膜表面过量表达，因此TPE-Man可以特异性识别TAMs。从流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜获得的数据证实了TPE-Man可以特异性识别TAMs。同时，TPE-Man也应用于组织切片染色，并显示与商业抗体染色的信号重叠度极高，说明TPE-Man可以替代抗体应用于疾病识别中。将负载TPE-Man的TAMs暴露于光照下，TPE-Man产生的ROS可以有效地杀死TAMs，达到预期的治疗效果。因此，我们认为我们成功开发了一种具有AIE活性的荧光探针，可以实现对TAMs的靶向成像和光动力学治疗。

Specific Targeting, Imaging, and Ablation of Tumor-Associated Macrophages by Theranostic Mannose-AIEgen Conjugates

(Anal. Chem., 2019, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b01053)

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