复旦大学张凡 Nat. Commun.： NIR-II生物发光探针用于活体内高信噪比成像和转移肿瘤追踪

【背景介绍】

光学成像具有非侵入性、实时、快速反馈和高灵敏度等优点，在活体生物医学成像分析和传感领域发挥着重要作用。在外部光源激发时，复杂生物器官和组织中内源性荧光团产生的自发荧光背景是获得具有高信噪比（SNRs）成像的主要限制之一。因此，生物发光成像、化学发光成像等无需外界光源照射的成像策略引起了研究人员的极大兴趣。目前，生物发光成像已被广泛用于跟踪细胞、肿瘤成像等。然而，常规生物发光成像的可见光波长短（400-700 nm），在体内成像时存在组织穿透不够、灵敏度低等问题。通过生物发光共振能量转移（BRET），生物发光成像的发射波长可扩展到近红外I区（NIR-I，700-900 nm），有助于肿瘤和淋巴结成像以及酶活性分子成像，但其生物组织的散射效应依然影响成像的信噪比和分辨率。近红外二区（NIR-II，1000-1700 nm）光学成像可以在深部组织（1 cm以上）中实现更高的空间分辨率。但是，活体内NIR-II荧光成像由于需要外部光照，不可避免地会出现自发荧光背景、并且会产生光致过热效应、照明不均匀等不良现象。

【成果简介】

近日，复旦大学的张凡教授和凡勇青年研究员（共同通讯作者）等人报道了一种生物发光探针（BPs），其通过使用一种特殊设计的花菁染料（FD-1029）进行生物发光共振能量转移（BRET）和两步荧光共振能量转移（FRET），即可在1029 nm处的NIR-II区生物荧光成像。该NIR-II-BPs具有良好的生物相容性，并成功应用于小鼠的血管和淋巴管成像，其信噪比（SNRs）相对于NIR-II荧光成像和常规生物发光成像提高了5倍、空间分辨率高约1.5倍。此外，NIR-II-BPs还具有多重成像能力，可以实现多个指标的同时检测。利用该生物发光探针的ATP响应特性，NIR-II-BPs能够以高达83.4的高肿瘤与正常组织比率（tumor/normal tissue(T/N)）来识别肿瘤转移。研究成果以题为“NIR-II bioluminescence for in vivo high contrast imaging and in situ ATP-mediated metastases tracing”发布在国际著名期刊Nature Communications上。

【图文解读】

图一、具有NIR-II生物发光的NIR-II-BPs的示意图

图二、NIR-II-BPs的合成与表征
（a）FD-1029的合成路线；

（b） FD-1029在DSPE-PEG₂₀₀₀胶束中的吸收光谱；

（c）FD-1029在DSPE-PEG₂₀₀₀胶束中的荧光发射光谱；

（d）Cy5、Cy7.5、FD-1029的UV/VIS/NIR吸收和发射光谱以及萤光素酶的生物发光；

（e）NIR-II-BPs在PBS缓冲液中的TEM图和的粒径分布；

（f）NIR-II-BPs在PBS缓冲液中的生物发光发射光谱和吸收光谱；

（g）NIR-II-BP在小鼠血清中的光稳定性；

（h）不同检测窗口中，在不同深度浸没有1％脂质的NIR-II-BPs填充的毛细管生物发光图像；

（i）以克（g）为单位的高斯拟合强度数据的FWHM与不同脂质内深度的关系。

图三、NIR-II生物发光和荧光成像之间信噪比和光热效应的差异
（a）光学成像示意图；

（b）在5 mm鸡胸组织下，NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像；

（c）具有不同厚度鸡胸组织的NIR-II-BPs毛细管的SNR，用于NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像；

（d）对鸡胸组织进行热效应研究的示意图；

（e）在808 nm、980 nm和1064 nm下连续照射30 min后，鸡胸组织的光热成像；

（f）在不同激发波长照射下，记录的鸡胸组织的温度变化曲线；

（g） 在808 nm、980 nm和1064 nm下连续照射30 min后，裸鼠皮肤的温度；

（h）在不同激发波长辐射下，记录裸鼠皮肤的温度变化曲线。

图四、外部激发光对NIR-II生物发光和荧光成像信号均匀性的影响
（a）非均匀照明的照片和示意图；

（b）在非均匀照明的NIR-II生物发光成像和NIR-II荧光成像中，填充NIR-II-BPs的光学成像；

（c）在NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像中，沿毛细管的强度分布；

（d）典型的Gaussian point扩散函数光斑；

（e）d中的Gaussian point扩散函数中，沿虚线的强度曲线具有相同的颜色；

（f）关于非均匀照明的体内研究插图；

（g-h）静脉注射NIR-II-BPs后，小鼠淋巴管上的NIR-II生物发光成像和NIR-II荧光成像；

（i）沿g、h的红色虚线的强度分布以及考虑到激发光强度分布的校正后的强度分布。

图五、比较NIR-II生物发光和荧光信号在血管和淋巴管上成像
（a-c）在静脉注射NIR-II-BPs后，小鼠腹部血管、淋巴管和脑血管的 NIR-II生物发光成像和NIR-II荧光成像；

（d-f）沿（a-c）白线的腹腔血管、淋巴管和脑血管的强度分布。

图六、使用NIR-II-BPs进行体内多重成像
（a）对CT-26肿瘤小鼠的双通道生物发光成像的照片；

（b）使用NIR-I-BPs和NIR-II-BPs对肿瘤组织、血管进行双通道生物发光成像；

（c）淋巴系统双通道生物发光成像的示意图；

（d）使用NIR-I-BPs和NIR-II-BPs对淋巴系统进行双通道生物发光成像。

图七、ATP介导NIR-II-BPs对肿瘤和转移瘤的成像
（a）裸鼠中相同肿瘤的VIS生物发光成像、NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像；

（b）（a）中不同的光学成像方法的T/N比；

（c）在携带淋巴结转移的裸鼠上，同时进行荧光成像和生物发光成像的示意图；

（d）淋巴结转移的荧光成像、生物发光成像和相应的高倍率成像；

（e）沿淋巴管的强度分布图；

（f）腹膜转移的NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像；

（g）（f）中相应序列号肿瘤的T/N比；

（h）（f）中转移性肿瘤边缘的H＆E染色结果。

【小结】

综上所述，作者利用工程化BRET和FRET工艺开发了具有生物相容性的NIR-II生物发光探针（NIR-II-BPs）。制备的NIR-II-BPs将生物发光范围从Vis扩展到NIR-II。这种自发光方式完全消除了体内成像过程中外部激发光的不利影响，因而能够实现血管和淋巴管以及肿瘤和转移的高分辨率成像。此外，通过精心选择荧光团、BRET-FRET方法可以成为一种实现具有不同发射波长的生物发光的通用方法，以满足不断增长的对高对比度多色成像和传感的需求。但是，生物发光成像仍存在发射效率低、需要独特的底物、对环境敏感的酶等缺点。这些缺点可能导致在体内NIR-II成像期间需要较长的成像时间、多次注入底物以及有限的生物环境。因此，未来需要开发具有更高灵活性和效率的可转染NIR-II生物发光探针上。

文献链接：NIR-II bioluminescence for in vivo high contrast imaging and in situ ATP-mediated metastases tracing.（Nature Communications, 2020, DOI: 10.1038/s41467-020-18051-1）

通讯作者简介

张凡教授简介：复旦大学教授、博士生导师 ，国家杰出青年基金获得者、中组部青年拔尖人才（万人计划）。

学习工作经历：

张凡教授于2008年获复旦大学化学系理学博士学位（导师：赵东元院士）。2008-2010年美国加州大学圣塔芭芭拉分校化学与生物化学系博士后（导师：美国两院院士Galen Stucky教授）。2010年8月通过复旦大学人才引进计划加入复旦大学化学系，2012年协调成立复旦-陶氏化学联合研究中心，任研究中心副主任，2013年底开始任复旦大学化学系教授。

研究兴趣及获奖：

张凡教授主要研究领域包括生物纳米技术及生物分析, 如早期癌症诊断与治疗，药物储存与释放，体内与体外生物成像等。发表SCI论文100余篇，多篇以通讯作者发表在Nat. Nanotechnol (1篇)，Nat. Commun（6篇），J. Am. Chem.Soc.（4篇），Angew. Chem. Int. Ed.（13篇），Adv. Mater. (6篇），Nano. Lett. (5篇）等生物化学相关国际一流期刊上，引用超过13000次，H index 62。25篇论文入选ESI“Highly Cited Papers”。2018年入选科睿唯安全球高被引学者。撰写出版英文专著2部（英国皇家化学会出版社和德国Springer-Nature出版社）。

获得教育部自然科学一等奖、侯德榜化工科技奖、上海市科技进步奖等奖、上海市青年英才科技奖等荣誉。受邀在国际会议上作大会邀请报告30余次，同时担任国际期刊Frontiers in Chemistry (Nanoscience Section)执行主编，Wiley出版社Small Structure, Particle & Particle systems characterization 和Analysis and Sensing以及《化学学报》、《分析化学》等国内外学术期刊编委。

本文由CQR编译。

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