俄亥俄州立大学Nature Nanotechnology：通过纳米粒子方向性控制RNA及相应配体达到治疗癌症的效果

【引言】

纳米材料是80年代中期发展起来的新型材料。纳米材料具有许多独特功能，而且用量少，但却赋予材料意想不到的高性能，附加值甚高。纳米复合高分子材料、纳米抗菌、保鲜、除臭材料等等，由于纳米材料的尺寸小，比血液中的红血球小一千多倍，比细菌小几十倍，气体通过其扩散的速度比常规材料快几千倍。纳米颗粒与生物细胞膜的化物作用很强，极易进入细胞内。此篇文章报道了纳米技术对RNA方向控制的优势。

【成果简介】

近日，俄亥俄州立大学的美国NIH纳米医学中心主任郭培宣教授（通讯作者）等人在Nature Nanotechnology上发表最新研究成果“Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression”。在该文中，研究团队报道了应用纳米技术来控制RNA方向的优势性。实验通过改变箭头状RNA的方向来控制细胞外囊泡膜上的配体，或调控干扰小RNA、微RNA的细胞内运输。在箭头状RNA的尾部放置膜锚定胆固醇使细胞外囊泡的外表面上出现RNA适体或叶酸。利用具有特定靶向的RNA配体与细胞外囊泡进行有效融合，由此得到的配体能够将siRNA精准递送至细胞，并有效地阻断三种癌症模型中的肿瘤生长。

【图文导读】

图1 修饰原生细胞外囊泡的RNA纳米技术 

a) 噬菌体phi29的扩展三通连接马达pRNA的原子力显微镜图像，色标表示幅度变化；

b) 3WJ箭头或箭头状胆固醇标记位置示意图；

c) 通过差速超速离心（UC）方法和缓冲垫修饰超速离心法纯化的HEK293T细胞的细胞外囊泡的负染电子显微镜（EM）图像；

d-g) 用纳米粒子跟踪分析方法进行的尺寸分析示意图和用于zeta电位测量的动态光散射示意图；

h) 二维结构（左图）和原生PAGE，用于从三个组分链组装的3WJ 示意图；

i) 细胞外囊泡负载与RNA适体的示意图。

图2 箭头状RNA和箭头状3WJ的作用比较 

a,b) 箭头状细胞外囊泡和箭头状3WJ的区别示意图；

c,d) 箭头状和箭头状Alexa647-3WJ/EV在牛胎血清中核糖核酸酶的降解情况，凝胶在Alexa647的通道上成像，凝胶成像（c）产生的条带通过图像（d）定量表示；

e-i) 比较受体阳性和阴性细胞中箭头状叶酸-3WJ的细胞结合能力；

e-g) 比较受体阳性和阴性细胞中箭头状细胞外囊泡的细胞结合能力；

h,i) 比较受体阳性和阴性细胞中叶酸的细胞结合能力。* p <0.05。

图3 含PSMA适体的细胞外囊泡在体外进行特异性结合与siRNA的递送 

a) PSMA RNA适体的细胞外囊泡与PSMA受体阳性和阴性细胞结合的流式细胞术（左）和共焦图像（右）。共聚焦图像中的核（蓝色），细胞骨架（绿色），RNA（红色）；

b) 通过细胞外囊泡向PSMA+前列腺癌细胞的PSMA-适体介导递送生存素siRNA的RT-PCR测定。统计：n=4；实验用四个生物学重复和二到四个技术重复进行ANOVA分析；校正：p=0.0120,0.0067，分别比较PSMAapt/EV/siSurvivin和PSMAapt/EV/siScramble和3WJ/EV/siSurvivin；

c) 对减少的细胞进行MTT测定。n=3，p=0.003,0.031，分别比较PSMAapt/EV/siSurvivin与PSMAapt/EV/siScramble和3WJ/EV/siSurvivin。* p <0.05，** p <0.01。

图4 使用含配体的细胞外囊泡抑制肿瘤生长 

a) 器官图像显示在将皮下细胞外囊泡的全身性叶酸注射到具有皮下KB细胞异种移植物的小鼠8小时后的特异性肿瘤靶向。n=2，两个独立的实验；

b) 用静脉内处理携带皮下LNCaP-LN3且异种移植PSMAapt/EV/siSurvivin或PSMAapt/EV/siScramble（均具有0.6mg/kg，siRNA/小鼠体重）的裸鼠，以注射PBS为对照，每周注射两次，注射三个星期。生物学重复n=10，两个独立的实验，并且统计数据使用以平均值和标准偏差表示的双侧t-检验来计算。第15,18天的p=0.347,0.6×10-2,1.5×10-6,8.2×10-8,2.1×10-7,1.0×10-7,1.9×10-7和1.8×10-6，22,25,29,32,36和39分别表示PSMAapt/EV/siSurvivin和对照组；

c) 用细胞外囊泡治疗期间小鼠的体重；

d) 用细胞外囊泡治疗后前列腺肿瘤中降低存活蛋白mRNA表达的趋势。

图5 乳腺癌原位异种移植小鼠模型中表皮生长因子受体适体可以提供生存素siRNA 

a) 有EGFR适体的细胞外囊泡对原位异种移植小鼠模型中乳腺肿瘤有增强的靶向作用。色标表示“方法”中定义的辐射效率；

b) 用EGFRapt/EV/siSurvivin和对照FBS（n=5）静脉内处理携带乳腺癌原位异种移植物的裸鼠。6周后，EGFRapt/EV/siSurvivin治疗组肿瘤大小明显小于其他对照组。将EGFRapt/EV/siSurvivin与EGFRapt/EV/siScramble进行比较，p=0.008；

c) 肿瘤提取物中蛋白质表达的分析显示EGFRapt/EV/siSurvivin处理显着降低了存活蛋白的表达。将EGFRapt/EV/siSurvivin与EGFRapt/EV/siScramble进行比较，p=0.0004；

d) 将从肿瘤中提取的RNA进行定量实时PCR测定，与对照相比，EGFRapt/EV/siSurvivin处理的小鼠中的存活蛋白mRNA减少。比较EGFRapt/EV/siSurvivin与EGFRapt/EV/siScramble，其中p=0.024。错误条表明s.e.m.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

图6 含叶酸的细胞外囊泡将生存素siRNA递送至患者衍生的结直肠癌异种移植物（PDX-CRC）的小鼠模型 

a) 用FA/EV/siSurvivin和对照FBS静脉内治疗携带PDX-CRC异种移植物的裸鼠（n=4）。6周后，相比于4周和5周时，FA/EV/siSurvivin治疗组的肿瘤显着缩小，FA/EV/siSurvivin和FA/EV/siScramble分别为p=0.0098和p=0.0387；

b) 治疗组与对照的肿瘤质量比较。比较FA/EV/siSurvivin与FA/EV/siScramble，p=0.0024。错误条表示s.e.m.*p<0.05，**p<0.01。

【小结】

这项研究使用RNA纳米技术对原生细胞外囊泡进行有效的重新编程。使用RNA纳米颗粒的方向来控制细胞外囊泡上的siRNA和miRNA的负载或在细胞外囊泡的表面实现有效的细胞靶向性，以及控制siRNA和miRNA的递送，且对癌症退化产生作用。在三种动物模型中，经过重新编程的细胞外囊泡表现出强大的生理化学性质，癌细胞特异性靶向性增强，且能有效释放细胞内siRNA以抑制肿瘤生长。

文章链接：Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression（Nature Nanotechnology，2017，DOI：10.1038/s41565-017-0012-z）

本文由材料人编辑部生物材料学术组昝菲供稿，材料牛编辑整理。

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