Adv. Mater.报道：仿烟草花叶病毒的策略用于治疗多药耐药癌症

【背景介绍】

在过去的几十年里，奇妙的自然界不断启发科学家对于生物体结构和功能的仿生。病毒（virus）是由核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态，靠寄生生活的介于生命体及非生命体之间的有机物种，可以感染几乎所有具有细胞结构的生命体。作为一种自然界中高度进化的纳米尺度的有机体，由于其高侵染性，被广泛用作药物和基因的载体。但是其毒性、变异性和免疫原性往往限制了生物安全性，已有报道一些不良病毒载体的案例。因此，开发高效、安全的人工病毒在生物医用材料研究领域中得到了越来越广泛的关注。人工病毒在生物医学应用中模仿（甚至超过）其原病毒的性能和效果。长期以来，狂犬病病毒、烟草花叶病毒等具有独特棒状形貌的病毒被用于药物递送、基因转染和肿瘤成像，因为它们具有的高长径比形态有利于长循环、肿瘤靶向、肿瘤渗透和细胞摄取。其中，TMV是一种典型的棒状病毒，是生物医学中最常用的病毒。在感染期间，TMV病毒粒子进入宿主细胞并在内质网（ER）中积累，从而导致ER形态发生巨大变化。同时TMV还能渗透到毗邻细胞中进行二次侵染。因此，构建结构/功能高度仿TMV的纳米粒子，通过合理的设计充分发挥其形貌优势，优化协调多机制抗肿瘤的策略非常具有研究前景。

目前，具有屏蔽、靶向、抗肿瘤功能的新一代溶瘤病毒，能够特异性感染和裂解恶性肿瘤细胞。通过保护病毒不被网状内皮系统（RES）过早消除，选择性的靶向癌症组织，并对病毒武装以前药、基因和细胞因子等“武器”，能显著提高抗癌效果。然而，多功能化可能导致各种功能相互间的交叉抗性。此外，病毒通过实体瘤传播仍然存在挑战，因为高的肿瘤选择性意味着避免非癌性细胞侵染，这往往限制病毒在整个肿瘤中扩散。因此，具有优异的溶瘤和细胞间扩散能力的人工病毒在抗癌方面很具潜力。

【成果简介】

近日，四川大学的顾忠伟教授团队报道了一种新策略，并利用该策略来构建了一种与棒状烟草花叶病毒（TMV）结构极为相似的人工烟草花叶病毒（ATMVs）。其中，ATMVs的设计巧妙地采用了屏蔽、靶向等方法，使其具有避免病毒被过早消除、选择性地靶向肿瘤组织和溶瘤能力的优点。这些负电荷的棒状颗粒在血液中隐匿长循环，直到其到达肿瘤深处部位，持续产生强大的复合溶瘤过程，包括：细胞膜渗透、内质网破坏以释放Ca²⁺、化疗递送和光热疗法。更重要的是，ATMVs不仅裂解初次侵染的细胞，而且渗透到相邻细胞中进行二次侵染，使细胞间扩散，甚至在实体瘤深处继续诱导裂解。该工作激发了具有独特形状的优化溶瘤功能的病毒样纳米粒子，该仿病毒粒子完全击败了大型耐药结肠癌（LoVo/Adr，约500 mm³）。研究成果以题为“Bioinspired Artifcial Tobacco Mosaic Virus with Combined Oncolytic Properties to Completely Destroy Multidrug-Resistant Cancer”发布在国际著名期刊 Adv. Mater.上。四川大学顾忠伟教授和南京工业大学徐翔晖教授为共同通讯作者，第一作者为四川大学2017级博士生吴花雨。

【图文解读】

图一、ATMVs用于治疗多药耐药性癌症的示意图
（A）ATMVs的制备示意图；

（B）细胞间和肿瘤内部的溶瘤示意图。

图二、ATMVs的纳米结构和释放效果
（A）SWNT-Rs、SSAPs和ATMVs溶液的紫外可见吸收光谱和荧光光谱；

（B）SWNT-Rs和ATMVs的TEM图像以及ATMVs的AFM图像；

（C）ATMVs的CD光谱；

（D）ATMVs溶液在808 nm（2.0 W cm^-2，7 min）激光照射下的光热曲线，以及线性时间数据相对于冷却过程的-ln(θ)（τ_s=342.25 s）；

（E）当pH从生理条件（pH=7.4）变为酸性（pH=6.5）时，ATMVs的表面电荷反转；

（F）当暴露于酸（pH=6.5，pH=5.0）和近红外辐射（2.0 W cm^-2）时，DOX释放。

图三、ATMVs的体外侵染过程
（A）各种对照组材料处理2 h后，利用荧光强度和拉曼光谱对cellar吸收进行定量；

（B）在有无近红外辐射下，用ATMVs处理2 h后，LoVo/Adr细胞的LDH泄漏和SEM图像；

（C）LoVo/Adr细胞的TEM图像显示，ATMVs处理24 h后，ATMVs粘附并破坏了细胞膜以及严重的ER粗糙扩展；

（D）LoVo/Adr细胞与ATMVs和SSAPs孵育0.5、6h后的2PLSM图像；

（E）在与SSAPs、ATMVs和ATMVs一起在NIR照射下孵育24 h后，LoVo/Adr的CLSM图像；

（F）用ATMVs和SSAPs预处理的细胞的荧光图像1 h，然后在有无NIR照射的情况下孵育0、1、3、6、9和12 h。

（G）用DOX·HCl、ATMVs和ATMVs在激光照射下处理24 h的LoVo/Adr细胞的CLSM图像；

（H）在用各种制剂处理48 h后，使用Annexin V/7AAD检测分析和流式细胞术分析LoVo/Adr细胞的凋亡。

图四、ATMVs的渗透效果
（A）分别与DOX·HCl、SSAP和ATMVs孵育1 h的预处理细胞扩散至邻近细胞的测试示意图；

（B）流式细胞仪测试了在A孔和B孔共培养12 h后DOX阳性细胞的速率，以及在A孔和B孔共培养48 h之后的活/死细胞的速率；

（C）由ATMVs诱导的二次侵染示意图；

（D）在用SSAPs和ATMVs（有无NIR照射）处理6 h后的3D LoVo/Adr MTS的2PLSM图像；

（E）注射各种制剂24 h后，冷冻切片的免疫荧光染色用于DOX、SWNT、DAPI和CD31标记的血管的肿瘤内分布；

（F）注射后24 h后，肿瘤10 μm厚的石蜡切片的伪彩色拉曼图；

（G）在静脉内注射各种制剂24 h后的定量结果，来自小鼠的肿瘤组织的光声图像的叠加。

图五、ATMVs的体内代谢、累积和抗肿瘤效果
（A）以静脉注射后的DOX和SWNT-R支架为特征的药代动力学曲线；

（B）静脉内注射各种制剂（以DOX含量为特征）后，在不同组织中的生物分布；

（C）静脉注射后，LoVo/Adr荷瘤裸鼠的荧光图像；

（D-E）在NIR辐射下，用红外热成像图像测量用ATMVs、RSAPs和SWNT-Rs治疗的小鼠中肿瘤组织的温度升高曲线和温度升高对肿瘤组织的暴露时间曲线；

（F）静脉注射生理盐水、DOX·HCl、SSAPs、RSAPs和ATMVs后，LoVo/Adr荷瘤裸鼠的肿瘤体积和存活率；

（G）肝转移的图片和肝组织的H＆E染色分析。

【小结】

       综上所述，作者报道了一种制备仿病毒的新策略，该策略高度模仿了天然TMV的细长结构和某种近似的生物行为，被称为人工烟草花叶病毒。设计了循环时间长、靶向肿瘤组织性强、溶瘤潜能强的ATMVs。独特的高光谱形态优化了溶解肿瘤功效，可以通过膜破坏、ER扰动、Ca2+释放、光热和化学疗法共同实现有效裂解。该药物不仅能裂解原发感染的细胞，而且还能渗透到邻近的细胞中进行二次侵染，从而使细胞间扩散并深入穿透实体瘤。此外，由于其突出的结构稳定性，ATMVs的完整性在持续感染的环境中可保持较长时间，表现出压倒性的深部溶瘤作用，以完全击败大型耐药结肠肿瘤。总之，该工作为新型病毒样策略提供了广泛的可能性，通过优化了独特的形态学特征以应对复杂的癌症环境，并最终杀死多药耐药癌症。

文献链接：Bioinspired Artificial Tobacco Mosaic Virus with Combined Oncolytic Properties to Completely Destroy Multidrug-Resistant Cancer.（Adv. Mater., 2020, DOI: 10.1002/adma.201904958）

本文由材料人CQR编译。

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